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脱细胞脱钙骨基质促红细胞生成素水凝胶促成骨
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摘要：0 引言 Introduction 严重骨折创伤、骨科手术等造成的骨组织缺损，引发患者运动系统功能严重缺失、生活质量急剧下降甚至威胁生命。据统计，在国内每年行骨科手术患者高达600 万，而
0 引言 Introduction
严重骨折创伤、骨科手术等造成的骨组织缺损，引发患者运动系统功能严重缺失、生活质量急剧下降甚至威胁生命。据统计，在国内每年行骨科手术患者高达600 万，而需要骨移植物则高达300 万之多[1]。近年来，随着生活水平的不断提高和老龄化趋势的进一步加重，当前对骨组织修复的需求越来越大，这些对骨科临床应用和骨组织重建修复研究领域都带来巨大挑战。
目前临床治疗骨缺损的方法主要有自体骨移植、同种异体骨移植及人工合成的生物材料替代物移植治疗等[2-3]。虽然自体骨移植物具有优良的成骨效果[4-5]，但自体骨移植物需要从自身骨组织获取，数量往往有限；此外，二次手术也增大了患者的痛苦和感染的风险[6]。同种异体骨移植物尽管来源丰富[7]，但存在免疫排斥和疾病传播的潜在风险[8]。近年来，基于人工合成生物材料制备的骨移植替代物已逐步应用到临床骨缺损修复治疗中[9-10]，但是这类材料的骨传导能力欠佳，并且随着材料在体内的降解会产生多种不良反应[11-12]。因此，设计和研究新的骨修复材料已经成为骨再生领域的重要研究方向之一。
近年来，以脱细胞脱钙骨基质(acellular decalcified bonematrix，ADBM)为代表的天然骨移植材料，由于与人体组织结构相似、生物相容性高等成为当前骨移植材料研究领域的一大热点[13-14]。ADBM 是通过利用物理、化学或者酶解等方法将骨组织中含抗原性的细胞成分去除，由此得到的几乎没有免疫原性或较低免疫原性的骨移植生物材料[15-16]。大量研究表明，ADBM 能够较好地保留骨组织中胶原等生物活性大分子及多种骨诱导生长因子，并且与骨组织有着更为相似的微结构特征，具有良好的生物相容性、生物力学性能及可降解特性等特点，而且可以和种子细胞及生长因子复合，是一种理想的骨修复材料，因此在骨缺损修复研究中有着巨大潜力和应用前景[13,17]。
ADBM 在骨缺损修复中的主要作用是促进骨再生，但骨修复过程中骨再生和血管生成是偶联在一起的，研究表明，血管再生在骨修复中具有关键作用[18]。促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)也叫红细胞刺激因子，是肾脏产生的由165 个氨基酸组成的糖蛋白激素，其分子质量约为30.4 kD，能够与EPO 特异性受体相互作用，在造血系统、中枢神经系统等多种部位发挥多种效应。据报道，EPO 参与了炎症性血管形成[19]、伤口愈合过程中血管新生及肿瘤新生血管形成等[19-21]。特别是近年来大量的研究证实，EPO 不仅可以激活造血干细胞JAK/STAT 信号通路，诱导骨形态发生蛋白2 的产生进而促进骨形成[22-24]，而且EPO 在体外也可以直接激活骨髓间充质干细胞形成成骨细胞，这一过程由mTOR 及ephrinB2/EphB4 等信号通路介导[25-26]。近年来有学者研究表明，EPO 可以通过上调骨髓间充质干细胞中的肝细胞生长因子从而诱导骨髓间充质干细胞的迁移[27]。
基于以上的研究背景，实验认为通过制备负载EPO 的ADBM(ADBM-EPO)水凝胶来发挥ADBM 成骨和EPO 成血管的双向作用，可能具有增强骨组织修复的作用。因此课题通过制备ADBM-EPO 水凝胶，并验证其缓释性能、促细胞迁移和成骨性能，初步探索ADBM-EPO水凝胶在骨损伤修复中的作用。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 体外对比观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2019 年6 月至2020 年9 月在首都医科大学附属北京同仁医院骨科实验室完成。
1.3 材料 市售新鲜猪股骨；人骨髓间充质干细胞及人脐静脉内皮细胞购于苏州赛业生物科技公司；EPO 购自苏州赛业生物科技公司；Human Erythropoietin ELISA Kit 试剂盒购自英国Abcam 公司；三氯乙胺、甲醇、乙二胺四乙酸(EDTA)、甲基磺酰氟(PMSF)、CaCl2、LiCl、Tris-HCl 缓冲液、TritonX-100、DNase I、RNase I、NaOH、多聚甲醛、结晶紫染液、乙醇、十六烷基吡啶溶液购自北京化学试剂公司；α-MEM培养基、M199 培养基、胎牛血清、内皮细胞生长因子、青霉素/链霉素双抗溶液、肝素、维生素C、碱性磷酸酶试剂盒购于美国赛默飞公司；Transwell 小皿购于美国康宁公司；基质胶(Matrigel)购于美国BD 公司。
1.4 实验方法
1.4.1 ADBM-EPO 水凝胶的制备 取市售新鲜家猪股骨近端和远端松质骨，切成5 mm 薄骨片，冲洗骨髓。将松质骨颗粒与三氯乙胺、甲醇脱脂液(质量体积比=30 ∶1)混合，4 ℃300 r/min 搅拌72 h，脱脂；将松质骨颗粒放入0.6 mol/L的HCl 中，搅拌条件不变，脱钙。加入2 mmol/L CaCl2溶液搅拌1 h，加入0.5 mmol/L EDTA 搅拌1 h，8 mmol/L 的LiCl 处理1 h 后，蒸馏水冲洗晾干，得到松质骨颗粒。
文章来源：《建筑材料学报》 网址: http://www.jzclxb.cn/qikandaodu/2021/0624/557.html