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羟基磷灰石壳聚糖复合二甲双胍用于大鼠骨缺损
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摘要：0 引言 Introduction 骨缺损常常见于先天性的发育畸形、创伤、感染及其他代谢性疾病等，临床上治疗骨缺损的最主要手段为自体骨移植，但是供骨区常常面临手术、感染、疼痛、神经血管
0 引言 Introduction
骨缺损常常见于先天性的发育畸形、创伤、感染及其他代谢性疾病等，临床上治疗骨缺损的最主要手段为自体骨移植，但是供骨区常常面临手术、感染、疼痛、神经血管损伤等问题，通过“支架材料”“生物活性因子”“种子细胞”构建的组织工程骨有望替代自体骨移植治疗骨缺损[1-3]。
羟基磷灰石具有良好的生物活性、骨传导性，且钙磷比与机体骨组织类似，被广泛应用于临床中作为骨修复材料，但羟基磷灰石脆性较大、机械强度不够高、降解速率较慢，限制了其在临床上的进一步使用[4-5]。来自蟹壳提取物的壳聚糖在骨组织工程中被广泛作为一种固化剂使用，在增加支架机械强度的同时于生物体内能有效降解，且不存在免疫原性[6-8]。二甲双胍作为治疗2 型糖尿病的明星药物，近来被多项研究证实能够刺激机体干细胞进行成骨分化，促进骨组织再生修复。二甲双胍具有热稳定作用且在在支架材料内能够缓慢释放，进而维持整个成骨过程。WANG 等[9]报道称二甲双胍通过Smad 信号通路诱导多能干细胞分化成为成骨细胞。SHAHREZAEE 等[10]将二甲双胍与聚己内酯结合构建骨组织修复材料并进行颅骨骨缺损修复，获得了良好的生物效果。针对二甲双胍联合羟基磷灰石用于骨缺损修复的研究，目前并不多见[11-14]。
基于以上研究背景，实验构建一种复合二甲双胍的羟基磷灰石生物支架用于修复SD 大鼠骨缺损，为骨缺损再生修复的相关研究提供相应实验数据。
1 材料和方法 Materials and methods
1.1 设计 动物对比观察实验。
1.2 时间及地点 实验于2017 年1 至6 月在湖北医药学院动物实验中心完成。
1.3 材料 二甲双胍(Sigma，批号：04635)；壳聚糖(Sigma，批号：)；羟基磷灰石(Sigma，批号：)；CT 扫描(JEOL-JSM-6390LV，日本)。
实验动物：8 周龄雄性SD 大鼠30 只，购自湖北医药学院学动物实验中心，合格证号：NO864。将30只大鼠随机分为3 组，分别为空白组、对照组及实验组，每组10 只。动物实验通过湖北医药学院伦理委员会通过()。
1.4 实验方法
1.4.1 制备复合支架材料 将二甲双胍溶于去离子水中制成10 μmol/L 的二甲双胍溶液，再往溶液里加入壳聚糖，使得壳聚糖的质量分数为10%。把羟基磷灰石与壳聚糖+二甲双胍溶液以质量比为2 ∶1 的比例混合制作成羟基磷灰石糊剂，再将此糊剂放入一个内直径为8 mm、高度为1 mm 的模具中，制备羟基磷灰石/壳聚糖/二甲双胍复合材料。将支架于37 ℃孵箱中晾干后浸泡在细胞培养液中，通过分光光度计计算培养液中二甲双胍浓度来检测支架材料中二甲双胍释放速率[15]。采用同样方法制备羟基磷灰石/壳聚糖复合材料，制作过程不添加二甲双胍[9]。
1.4.2 骨缺损模型制备与分组修复 以30 mg/kg 戊巴比妥腹腔麻醉成功后，沿大鼠颅骨矢状缝切开皮肤、皮下筋膜及肌肉，暴露大鼠顶骨，以5 mm 直径空心钻沿矢状缝两侧进行骨缺损造模，注意全程生理盐水降温并避免损伤硬脑膜，空白组不植入任何材料，对照组、实验组分别植入羟基磷灰石/壳聚糖、羟基磷灰石/壳聚糖/二甲双胍复合材料，缝合大鼠颅骨周围肌肉、皮下筋膜及皮肤，注意无菌操作，术后连续注射3 d 青霉素预防感染[16-17]。
1.5 主要观察指标
二甲双胍释放量：利用分光光度计计算细胞培养液中1，3，7，14，21 d 的二甲双胍的浓度，并计算支架中二甲双胍释放百分比。
X 射线片观察：术后3 个月，将SD 大鼠麻醉后送放射科进行颅骨正位X 射线摄片，观察各组颅骨骨缺损修复情况。
Micro-CT 观察：术后3 个月，X 射线摄片后进行颅骨CT扫描，将CT 值调至颅骨骨窗后观察颅骨骨缺损修复情况，并进行定量分析。所有标本通过IPP 6.0 软件进行新生骨体积定量分析。新生骨体积百分比(%)=新生骨体积/缺损总体积×100%。
组织学分析：取大鼠颅骨骨缺损标本，中性甲醛固定后进行脱钙处理，待脱钙完成后进行脱水包埋，制备石蜡切片，苏木精-伊红染色。每个标本于高倍镜下随机选择6 个视野进行拍照，通过IPP 6.0 软件进行新生骨面积及新生血管密度定量分析，观察骨缺损处新生骨组织、新生血管情况。新生骨面积百分比(%)=新生骨面积/缺损总面积×100%，新生血管密度=新生血管数/缺损面积[18]。
1.6 统计学分析 使用SPSS 22.0 统计软件对数据进行分析，数据以表示，单因素方差分析比较组间差异，以P＜ 0.05表示差异有显著性意义。若组间差异相同，则进行LSD 检验，置信区间为95%。
文章来源：《建筑材料学报》 网址: http://www.jzclxb.cn/qikandaodu/2021/0624/558.html